تجزیه و تحلیل داده های عمومی

اطلاعات مربوط به دودمان SARS-CoV-2 و تاریخ نمونه برداری از توالی های موجود از شیلی از سایت Consorcio Genomas CoV2 موجود در https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. داده‌های واکسیناسیون از داده‌های عمومی وزارت علوم، فناوری، دانش و نوآوری در دسترس به‌دست آمد https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (محصول 83).

سنجش عفونت

همانطور که قبلا توضیح دادیم، ویروس‌های کاذب حامل پروتئین‌های مختلف SARS-CoV-2 تهیه شدند.¹². به طور خلاصه، شبه‌گونه‌های SARS-CoV-1 مبتنی بر HIV-2 در سلول‌های HEK293T با ترانسفکت کردن pNL4.3-ΔEnv-Luc همراه با وکتور کدکننده سنبله pCDNA-SARS-CoV-2 مربوطه در نسبت مولی 1:1 تولید شدند. پلاسمیدهایی که یک سنبله بهینه شده با کدون را کد می کنند که فاقد 19 اسید آمینه آخر انتهای C ترمینال (SΔ19) شناخته شده برای جلوگیری از احتباس در شبکه آندوپلاسمی است.¹² با سنتز ژن یا جهش زایی سفارشی شده توسط سایت (GeneScript) به دست آمد و حاوی جهش های زیر بود: دودمان A (توالی مرجع)، دودمان B (D614G)، دودمان B.1.1.7 (Δ69-70، Δ144، N501Y، A570D، D614G ، P681H ، T716I ، S982A ، D1118H) ، اصل 1، L18Q، F20S، D26G، T138N). هر آماده سازی شبه با سانتریفیوژ در 190 دور در دقیقه در دمای اتاق پاکسازی شد، با استفاده از کیت الایزا کوانتیکین HIV-417 Gag p484 (سیستم های تحقیق و توسعه)، در 501% سرم جنین گاو (Sigma-Aldrich) تقسیم شد و در دمای 614- درجه سانتیگراد نگهداری شد. استفاده کنید. مقادیر متفاوتی از ویروس‌های شبه تایپ شده (همانطور که توسط سطوح پروتئین HIV-655 p1027 تعیین می‌شود) برای آلوده کردن سلول‌های HEK-ACE37 استفاده شد و 75 ساعت بعد، فعالیت لوسیفراز کرم شب‌تاب با استفاده از معرف سنجش لوسیفراز (Promega) در میکروپلیت Glomax 76 اندازه‌گیری شد. نور سنج (Promega).

سنجش خنثی سازی

سنجش‌های خنثی‌سازی ویروس کاذب اساساً همانطور که قبلاً توضیح دادیم انجام شد¹². به طور خلاصه، رقت‌های سریالی نمونه‌های پلاسما (1:4 تا 1:8748) در DMEM با 10% سرم جنین گاوی تهیه شد و با 5 نانوگرم p24 از هر ویروس شبه در طول 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و سپس 1×10 انکوبه شد.⁴ سلول های HEK-ACE2 به هر چاهک اضافه شد. سلول های HEK293T (بدون بیان ACE2) انکوبه شده با ویروس شبه تایپ شده (نسب A) به عنوان کنترل منفی استفاده شد. سلول ها 48 ساعت بعد لیز شدند و فعالیت لوسیفراز کرم شب تاب با استفاده از معرف سنجش لوسیفراز (Promega) در روشنایی سنج Glomax 96 Microplate (Promega) اندازه گیری شد. درصد خنثی سازی برای هر رقت محاسبه شد و ID50 هر نمونه با استفاده از GraphPad Prism نسخه 9.0.1 محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism نسخه 9.1.2 انجام شد. مقایسه‌های چند گروهی برای تیترهای آنتی‌بادی خنثی‌کننده (NAbTs) در برابر پانلی از ویروس‌های شبه SARS-CoV-2 و همچنین مقایسه پاسخ‌های NAbs بر اساس جنسیت و وضعیت دود با استفاده از تست رتبه‌بندی علامت‌دار Wilcoxon انجام شد. تغییر فاکتور به صورت اختلاف میانگین هندسی تیتر در شناسه محاسبه شد₅₀ در مقایسه با ویروس شبه نوع وحشی. تجزیه و تحلیل همبستگی بین NAbTs و سن یا BMI با استفاده از آزمون اسپیرمن انجام شد. آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون مقایسه چندگانه توکی برای تجزیه و تحلیل آماری آلودگی انجام شد. مقدار p ≤0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

تأیید اخلاقی

پروتکل مطالعه توسط کمیته اخلاق دانشکده پزشکی در دانشگاه شیلی (پروژه های شماره 0361-2021 و شماره 096-2020) و کلینیک سانتا ماریا (پروژه شماره 132604-21) تأیید شد. همه اهداکنندگان رضایت نامه آگاهانه را امضا کردند و نمونه های آنها ناشناس شد.

تأثیر جهش های سنبله ای در نوع لامبدا بر عفونت و خنثی سازی پاسخ آنتی بادی ها

تجزیه و تحلیل 3695 توالی از شیلی که در 24 ژوئن در GISAID سپرده شده است^th سال 2021 تسلط واضحی از گونه‌های SARS-CoV-2 گاما و لامبدا را در طول سه ماهه آخر، روی هم، برای 79 درصد از تمام توالی‌ها نشان می‌دهد.

جالب توجه است که این دوره با یک کمپین گسترده واکسیناسیون مشخص شده است که در آن 65.6٪ از جمعیت هدف (افراد 18 ساله و بالاتر) یک طرح کامل واکسیناسیون را در 27 ژوئن دریافت کرده اند.^th 2021

با توجه به اینکه 78.2 درصد از افراد تلقیح شده با یک طرح کامل، واکسن ویروس غیرفعال CoronaVac را از Sinovac Biotech دریافت کردند، ما به دنبال بررسی تأثیر جهش‌های سنبله موجود در نوع لامبدا بر ظرفیت خنثی‌سازی آنتی‌بادی‌های استخراج‌شده توسط این واکسن بودیم.

برای این کار، ما ویروس‌های شبه SARS-CoV-1 مبتنی بر HIV-2 تولید کردیم که حامل پروتئین اسپایک از دودمان مرجع ووهان-1 (نوع وحشی؛ دودمان A)، جهش D614G (نسب B) و آلفا (نسب B) بودند. انواع .1.1.7)، گاما (نسب P.1) و لامبدا (نسب C.37).

در طول آماده سازی ویروس، ما به طور مداوم مشاهده کردیم که سلول های آلوده به ویروس کاذب حامل سنبله لامبدا در مقایسه با جهش یافته D614G یا انواع آلفا و گاما، مقادیر بیولومینسانس قابل توجهی بالاتری تولید کردند که نشان دهنده افزایش عفونت ناشی از پروتئین سنبله لامبدا است.

شکل 1.عفونت با واسطه پروتئین های مختلف سنبله.

(الف) نمایش شماتیک پروتئین SARS-CoV-2 و انواع مورد استفاده در این مطالعه. دودمان در پرانتز نشان داده شده است. RBD، دامنه اتصال گیرنده، CM. دم سیتوپلاسمی

(ب) تیتراسیون شبه‌گونه‌های هر دودمان با استفاده از مقادیر معادل HIV-1 p24. فعالیت لوسیفراز کرم شب تاب به عنوان واحدهای لومینسانس نسبی (RLU) در 48 ساعت پس از آلودگی اندازه گیری شد. میانگین و SD از یک آزمایش سه تکراری محاسبه شد.

در مرحله بعد، ما از ویروس‌های کاذب ذکر شده در بالا برای انجام سنجش‌های خنثی‌سازی با استفاده از 79 نمونه پلاسما از کارکنان بهداشتی سالم از دانشگاه شیلی و کلینیک سانتا ماریا در سانتیاگو، شیلی استفاده کردیم.

ما 4 نمونه را حذف کردیم زیرا قادر به محاسبه تیتر ID50 نبودیم. از نمونه های مورد تجزیه و تحلیل، 73 درصد مربوط به زنان، میانگین سنی 34 سال (IQR 29-43) و شاخص حداکثر بدن (BMI) 25 (IQR 22.7-27) بود. 20.5 درصد از شرکت کنندگان اعلام کردند که در طول دوره ایمن سازی سیگاری فعال هستند. نمونه ها به طور متوسط 95 روز (IQR 76 - 96) پس از دوز دوم واکسن CoronaVac به دست آمد.

ما مشاهده کردیم که خنثی سازی ویروس کاذب حامل پروتئین سنبله نوع وحشی منجر به رقت 50 درصدی مهاری شد (ID₅₀میانگین تیتر 191.46 (154.9 - 227.95، 95% CI،)، در حالی که 153.92 (115.68 - 192.16، 95% CI)، 124.73 (86.2 - 163.2، 95 - 104.57، 75.02 - 134.11، 95% CI، 78.75%) بود. CI ) و 49.8 (107.6 - 95، 614% CI) برای ویروس های شبه که حامل پروتئین اسپایک از جهش یافته DXNUMXG یا انواع آلفا، گاما و لامبدا هستند.

ما همچنین مشاهده کردیم که تیتر میانگین هندسی ID₅₀ تیترها با ضریب 3.05 (2.57 - 3.61، 95٪ CI) برای ویروس شبه حامل سنبله لامبدا، 2.33 (1.95 - 2.80، 95٪ CI) برای سنبله گاما، 2.03 (1.71 - 2.41٪ CI) کاهش یافت. برای سنبله آلفا و 95 (1.37 - 1.20، 1.55٪ CI) برای سنبله D95G در مقایسه با سنبله نوع Wild.

هیچ ارتباطی بین جنس، سن، شاخص توده بدن (BMI) یا وضعیت دود و تیتر آنتی بادی خنثی کننده در گروه مطالعه ما مشاهده نشد.

شکل 2.سنجش خنثی سازی با استفاده از نمونه های پلاسما از واکسن های CoronaVac

(الف) تغییرات در تیتر خنثی سازی متقابل 50% (ID₅₀) در نمونه های پلاسما از 75 گیرنده واکسن CoronaVac علیه D614G (نسب B)، آلفا (نسب B.1.1.7)،

انواع گاما (نسب P.1) و لامبدا (نسب C.37) در مقایسه با ویروس نوع وحشی. نتایج به عنوان تفاوت در تیترهای خنثی سازی نمونه های همسان نشان داده می شود. مقادیر P برای مقایسه ID₅₀ با آزمون رتبه علامت دار ویلکاکسون محاسبه می شوند.

(B) نمودارهای جعبه ای محدوده میانه و بین ربعی (IQR) ID را نشان می دهد₅₀ برای هر ویروس کاذب تغییرات فاکتور به صورت اختلاف میانگین هندسی در شناسه نشان داده می شود₅₀ در مقایسه با ویروس های شبه نوع وحشی. تجزیه و تحلیل‌های آماری با استفاده از آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار جفت همسان ویلکاکسون انجام شد.

با هم، داده‌های ما نشان داد که پروتئین سنبله نوع جدید مورد علاقه لامبدا، که به شدت در شیلی و کشورهای آمریکای جنوبی در گردش است، حامل جهش‌هایی است که باعث افزایش عفونت و توانایی فرار از آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده ناشی از CoronaVac می‌شود.

چه چیزی را از این مقاله باید حذف کرد:

An analysis of 3695 sequences from Chile deposited at GISAID as per June 24th 2021 shows a clear dominance of the SARS-CoV-2 variants Gamma and Lambda during the last trimester accounting, together, for the 79% of all sequences.
Different amounts of pseudotyped viruses (as determined by the levels of the HIV-1 p24 protein) were used to infect HEK-ACE2 cells and 48 hours later, firefly luciferase activity was measured using the Luciferase Assay Reagent (Promega) in a Glomax 96 Microplate luminometer (Promega).
2% of the people inoculated with a complete scheme received the inactivated virus vaccine CoronaVac from Sinovac Biotech, we sought to investigate the impact of the spike mutations present in the Lambda variant on the neutralizing capacity of antibodies elicited by this vaccine.